En cuanto a los afiches que visité,el primero se titulaba “Functional Analysis of Rhesus Macaca mulattaCollangenasa (MMP1) and Gelatinase (MMP2) Domains, Important for Eye Develpment, Vision and Ocular Diseases”. Este fue presentado por la estudiante del Recinto Universitario de Cayey Angiemar Maldonado. En esta investigación han logrado observar que tanto la matriz metaloproteasa colagenasa (MMP1) como la matriz metaloproteasa gelatinasa (MMP2) tienen dominios conservados en los monos Rhesus Macaca mullatta. Estos proteínas son importantes para futuras terapias de enfermedades oculares ya que estas se han visto envueltas en varias condiciones de este índole. El afiche fue un completo con todas las partes que requería y la presentadora mostro dominar muy bien lo que estaba haciendo.

Luego pase por el afiche de José Javier Díaz-Torres, estudiante de Biotecnología Industrial del Recinto Universitario de Mayagüez. Su afiche llevaba como título “A proteomic Analysis of Pelletization in Liquid Cultures of Phanerochaete chrysosporium”. Este hongo promete ser uno de gran utilidad para procesos industriales ya que logra degradar lignocelulosa entre otras características. El problema es que hongos filamentosos como este son difíciles de crecer en medios acuosos que son los que se utilizan en la industria. Precisamente de esto se trata esta investigación, en la que tienen como meta caracterizar proteínas que estén envueltas en la producción de pequeños gránulos que favorecen el crecimiento en medio acuoso. En general el afiche constaba con todas sus partes con figuras y diagramas que ayudaban mucho a entender. Además el estudiante José Jvier presento muy bien sus ideas y su investigación.

Durante este semestre he tenido el problema de que he estado asistiendo a entrevistas para empezar escuela graduada en agosto. Debido a esto he estado ausente varias veces impidiéndome asistir al laboratorio como de costumbre. Además, he estado intentando unos experimentos que no me están saliendo como esperaba. Para esto, voy a hacer unas modificaciones al protocolo y ver si obtengo resultados. Debido a esto pienso que he logrado solo un 10% de los objetivos para este semestre, pero espero ir avanzando para al final del semestre lograr todas las metas establecidas. Aquí les presento el “abstract” del poster que voy a presentar durante el Anual Poster Day de Bio-MINDS:

The immune system is in charge of protecting the body against pathogens but sometimes it fails and produces an immune response against its own cells. When this happens it is known as an autoimmune disease. These conditions are a major threat to the health of all Americans. At least ten million people (mostly women) in the United States suffer from an illness caused by autoimmunity. In addition, various autoimmune diseases have markedly higher incidence in Puerto Ricans, such as diabetes mellitus type 1. It is readily apparent that more knowledge of the patho-physiology of autoimmune diseases is needed. There is a process by which the immune system does not attack an antigen called immunological tolerance, and B-cells that participate in this process are called anergic. Several autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and diabetes are associated with loss of immunological tolerance. Therefore, understanding how immunological tolerance is maintained for self-antigens is important to understand how autoimmunity is triggered. Previous studies have shown that anergic B-cells from an anti-insulin mouse model have impaired calcium (Ca²⁺) mobilization from the endoplasmic reticulum (ER), reduced basal levels of nuclear factor of activated T cells (NFATc1) and reduced NFATc1 mobilization following B-cell receptor (BCR) stimulation. These processes are crucial in the activation of B-cells. BCR signals lead to the production of inositol 1,4,5-triphosphatate (IP₃) that interacts with a Ca²⁺ channel in the ER, IP₃ receptor (IP₃R), that induces the release of Ca²⁺ from the ER. Since the impaired Ca²⁺ mobilization is due to intracellular Ca²⁺ stores, we hypothesized that the IP₃R function is impaired in anergic B-cells leading to disrupted mobilization of Ca²⁺. For this reason, our aim is to characterize IP₃R in order to compare this protein with its counterpart in anergic B-cells. Since all human cells have the IP₃R we are currently using HeLa cells and hFOB cells for our experiments. We have successfully detected the IP₃R in HeLa cells via immunobloting. Future experiments will assess the phosphorylation status of IP₃R and potential IP₃R interactions with other proteins.

Como mencioné, voy a estar intentando hacer co-inmunoprecipitación. Para esto lo que seva a añadir el anticuerpo para IP3R (anti-IP3R) al lisado celular para que se forme el complejo anticuerpo-proteína. A estos complejos se le conocen como complejos inmunes. Luego se incubara con agarosa que contiene proteína A. La proteína A interacciona con el anti cuerpo del complejo inmune. Al hacer centrofugación, se precipitara la agarosa con proteína A, y el anticuerpo que a su vez tiene el IP3R y cualquier proteína que estuviera interaccionando con el receptor en la célula. Luego la muestra se analizara con SDS-PAGE y Western Blof utilizando distintos anticuerpos para analizar si el receptor esta interaccionando con alguna proteína.

Ya que tenemos un método con el cual podemos detectar el receptor de IP3, el semestre siguiente estaremos utilizando este método para poder caracterizar esta proteína en linfocitos B. Además estaremos observando con que proteínas interacciona este receptor en respuesta a diferentes estímulos, como por ejemplo estimulación por el “B-cell receptor”. También causaremos apoptosis en estas células y observar lo mismo, ya que se cree que este receptor juega un rol importante en las rutas apoptóticas de linfocitos B.  

Causamos lisis a las células para obtener un extracto celular, cuantificamos la proteína y luego corrimos una gel SDS-PAGE. Este gel no nos salió muy “bonito” y pues tenemos que volver a hacerlo para luego poder hacer un “Western Blot” para ver si podemos identificar el receptor de IP3 en la gel. Con este que hemos hecho puedo decir que el progreso con respecto a las metas para este semestre está entre 2 y 3 en la escala.

     Este proyecto es un poco diferente al proyecto del semestre pasado pero siempre estuvimos revisando literatura sobre este tema para empezar a trabajar este semestre. En el laboratorio del Dr. Carlos Acevedo se va a seguir trabajando en el proyecto del cual yo estuve escribiendo en mi Blog el semestre pasado pero yo solamente voy a estar trabajando en esta nueva investigación.

     Para lograr los objetivos de este semestre necesito aprender las técnicas de inmunoprecipitación y co-inmunoprecipitación. Estas técnicas se usan para precipitar una proteína específica. En el caso de la inmunoprecipitación se precipitara proteína de estudio sola y  en la co-inmunoprecipitación se precipita la proteína de estudio junto con las proteínas que esta este interaccionando. Luego aprenderé  a trabajar con la técnica de “Western Blot” para ver con que proteína esta interactuando la proteína de interés y que tipo de modificación se lleva a cabo en la proteína al estimular el linfocito.

     El diseño experimental básicamente era hacer una cirugía para causar sépsis en los ratones PD-1-/- y WT, uno o dos días después los sacrificaba y aislaba macrófagos de la cavidad peritoneal y/o linfocitos T del bazo. Luego con estas células hacia los ensayos de migración.

     Los resultados que obtuvimos indican que los macrófagos extraídos de ratones con sépsis tienen mayor capacidad migratoria 24 y 48 horas después de la cirugía que ratones sin sépsis. Además también observamos que la deficiencia del receptor PD-1 hace que los macrófagos migren menos cantidad 48 horas después de la cirugía. Estos resultados junto con los resultados previamente obtenidos en el laboratorio donde trabaje, ayudan a entender el mecanismo por el cual ratones PD-1-/- tienen mejor sobrevivencia que los ratones WT.  Esto es importante ya que en un futuro se puedo utilizar un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 como terapia para pacientes con sépsis.  

     Aparte de la experiencia investigativa también conocí mucha gente chévere y lugares nuevos y el simposio al final del verano estuvo bien bueno también. En fin la experiencia en general me gusto mucho y se la recomiendo a los que no han participado en programas como estos.

Gracias a estar trabajando en investigación este semestre he estado constantemente en contacto con literatura científica de temas que me interesan como la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa. Esto me ha servido de mucho ya que cada “paper”  que discutimos en el laboratorio lo hacemos a detalle y así desarrollamos nuestras destrezas de analizar además de que ampliamos nuestros conocimientos en estas áreas.

El hecho de que al final de semestre tenia que presentar un informe de mi trabajo en el semestre me a ayudado a ser mas organizado. Ya que en cierta manera estaba obligado a tener mi libreta de laboratorio al día y tener los datos y observaciones bien organizados para que se me hiciera más fácil hacer el informe final.

Precisamente esto fue lo que más difícil se me hizo este semestre. El hecho de tener que organizar mi tiempo entre las clases y el laboratorio además de ser organizado en el laboratorio. Pero pude superar esto enfocándome en las metas que me había trazado para este semestre.

En el transcurso de este semestre la investigación ha ido un poco lenta por varios factores como permisos necesarios para el muestreo. El semestre que viene esperamos poder hacer el muestreo de los fluidos epiteliales de los coquies. Además esperamos comenzar un nuevo proyecto del cual hemos estado leyendo. A grandes rasgos este nuevo proyecto trata sobre observar diferencias entre la traducción de señales que se desata al activar un linfocito B normal con la de un linfocito B anérgico. Para este proyecto necesito aprender nuevas técnicas las cuales son muy utilizadas en la investigación hoy día como inmunoprecipitación. Este nuevo proyecto me interesa mucho y estoy ansioso por comenzar a trabajar en él.

El propósito principal de la investigación en la cual trabajo es encontrar nuevas alternativas al creciente problema de bacterias resistentes a los antibióticos comúnmente usados. Seria de gran relevancia y beneficio que encontráramos actividad antimicrobiana en los fluidos secretados por la piel del coquí. Se espera encontrar nuevos péptidos antimicrobianos, ya que se ha visto que cada especie de anfibio secreta sus propios péptidos antimicrobianos. Incluso estos nuevos péptidos podrían tener actividad en contra de microorganismos que aun no se les conoce antibiótico que funcione en contra de ellos.  Este es el caso de un péptido que se logro aislar de una rana en los bosques de Costa Rica que inhibe el crecimiento del  virus causante de SIDA.

Por otro lado al visitar los blogs de varios compañeros del programa pude ver la diversidad que existe en las investigaciones que se están llevando a cabo en las distintas universidades del sistema UPR. De los blogs que visite el que mas me llamo la atención fue el de Samuel, que trabaja en el laboratorio del profesor Rubén Díaz en el Departamento de Ingeniería Mecánica.  El laboratorio en el cual trabaja este compañero esta investigando como nueva alternativa de “drug delivery”  la electroporación. Pienso que esta es una alternativa novedosa en esta área de investigación que en estos últimos años esta bajo mucho estudio.